在微生物控制中，表面微生物總數(shù)可以作為評(píng)估生產(chǎn)過(guò)程中微生物污染風(fēng)險(xiǎn)的級(jí)別。微生物采樣涉及醫(yī)療、食品衛(wèi)生、制藥工業(yè)、航空航天等各個(gè)領(lǐng)域，而物體表面微生物采樣更是其中極重要的一個(gè)方面表面微生物取樣相對(duì)比較困難，微生物附著在物體表面上，如果微生物采樣方法不適合，很難檢測(cè)到實(shí)際微生物數(shù)量。在實(shí)際微生物采樣過(guò)程中物體表面的材質(zhì)和粗糙度都有所不同，不同的污染媒介和微生物都會(huì)影響采樣結(jié)果。

拭子采樣法于 1997 年被作為定量和半定量表面微生物采樣的標(biāo)準(zhǔn)方法，主要借助消毒拭子擦拭待檢測(cè)表面，再轉(zhuǎn)移到培養(yǎng)皿中進(jìn)行培養(yǎng)；而新版 GMP 和藥典中均提及接觸皿采樣法可作為表面微生物采樣方法，本研究通過(guò)接觸皿采樣法、拭子采樣法、淋洗采樣法進(jìn)行比較，評(píng)估了各采樣法的采樣效果，為接觸皿采樣法的應(yīng)用提供借鑒。

材料與方法

1. 所需材料、試劑及儀器

金黃色葡萄球菌 ATCC6538

大腸埃希菌ATCC25922

枯草芽胞桿菌ATCC6633

銅綠假單胞菌 ATCC9027  

白色念珠菌ATCC10231

黑曲霉 ATCC16404

型培養(yǎng)箱、型菌落計(jì)數(shù)儀

316L 型不銹鋼板

接觸皿

胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基( TSA)接觸皿; 

沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基( SDA) 接觸皿; 

營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基( NA) 接觸皿

PH = 7.0 氯化鈉蛋白胨緩沖液

2. 方法

2.1  菌懸液配制 

接種金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌、銅綠假單胞菌、枯草芽胞桿菌至胰酪 TSA 培養(yǎng)基斜面中，于 30 ℃ ～ 35 ℃ 培養(yǎng) 18 h ～ 24 h; 接種黑曲霉、白色念珠菌至 SDA 培養(yǎng)基斜面中，于 23 ℃ ～ 28 ℃培養(yǎng) 48 h ～72 h，上述培養(yǎng)物用 0.9% 無(wú)菌氯化鈉溶液制成每0． 1 ml含菌數(shù)分別為1 cfu ～ 10 cfu 的低濃度菌懸液和50 cfu ～ 100 cfu 的高濃度菌懸液，并在 24 h 內(nèi)使用。

2.2 菌種載體的制備 

取面積為 25 cm2 的 316L不銹鋼板作為載體。載體于染菌前，應(yīng)進(jìn)行脫脂和滅菌處理。采用濕熱滅菌法( 121 ℃，30 min) 對(duì)經(jīng)過(guò)脫脂處理后的載體進(jìn)行滅菌處理。將經(jīng)滅菌的載體平鋪于無(wú)菌平皿內(nèi)，逐片滴加菌液，菌液滴加量每片為0.1 ml，將菌液均勻擦拭整個(gè)載體表面，滴染菌液后于層流臺(tái)下吹干。

2.3 具體操作

將制備后的菌種載體分為 2 組，每組 3 片 ～ 5 片，分為取樣檢測(cè)組和實(shí)際活菌檢測(cè)組，同時(shí)另取 3 片未染菌的載體做為陰性對(duì)照組。

取樣檢測(cè)組: 使用待評(píng)估的微生物取樣方法對(duì)菌種載體微生物進(jìn)行采樣，制備供試液后檢測(cè)各菌種載體上活菌數(shù)。

實(shí)際活菌檢測(cè)組: 將菌種載體放入裝有 100 ml 生理鹽水的燒杯中，使用漩渦振蕩器振蕩 3 min 后，取出燒杯中的生理鹽水作為供試液，采用薄膜過(guò)濾法在TSA( 細(xì)菌) 或 SDA( 霉菌) 90mm 平板培養(yǎng)基上培養(yǎng)，檢測(cè)菌種載體上菌落數(shù); 分別對(duì) 3 個(gè)菌種載體進(jìn)行檢測(cè)，以3 次檢測(cè)結(jié)果的平均值作為菌種載體的實(shí)際活菌數(shù)。

陰性對(duì)照組: 將未染菌的載體放入裝有 100 ml 生理鹽水的燒杯中，使用漩渦振蕩器振蕩 3 min 后，取出燒杯中的生理鹽水作為供試液，采用薄膜過(guò)濾法分別在 TSA及SDA90mm 平板培養(yǎng)基上培養(yǎng)，進(jìn)行活菌計(jì)數(shù)，以 3 片未染菌的載體計(jì)數(shù)結(jié)果的平均值作為陰性對(duì)照結(jié)果。

接觸皿采樣法：

TSA、NA 和SDA 培養(yǎng)基接觸皿( φ55 mm，面積為25 cm2 ) ，取下皿蓋將培養(yǎng)基凸起面按壓到采樣物體表面5 s ～ 10 s 后，將皿拿起蓋好皿蓋，細(xì)菌置于30 ℃ ～ 35 ℃培養(yǎng)48 h，真菌于23 ℃ ～28 ℃培養(yǎng)72 h 觀察計(jì)數(shù)。TSA 接觸皿測(cè)試菌種為金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌、銅綠假單胞菌、枯草芽胞桿菌、黑曲霉、白色念珠菌; NA 接觸皿測(cè)試菌種為金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌、銅綠假單胞菌、枯草芽胞桿菌; SDA 接觸皿測(cè)試菌種為黑曲霉、白色念珠菌。

淋洗采樣法：

將20 ml 生理鹽水緩緩傾注到裝有菌種載體的平皿中，傾注時(shí)注意液體傾注點(diǎn)處于菌種載體中心位置，全部?jī)A注后，將無(wú)菌平皿輕輕向上下左右各晃動(dòng)5 次，晃動(dòng)幅度大概在2 cm ～3 cm，之后使用移液槍將平皿中的生理鹽水全部取出，作為供試液，取10 ml 進(jìn)行活菌計(jì)數(shù)，采用薄膜過(guò)濾法，濾干后取出濾膜，細(xì)菌濾面朝上貼于TSA 90mm平板培養(yǎng)基和NA 90mm平板培養(yǎng)基上，真菌濾面朝上貼于SDA90mm平板培養(yǎng)基上，細(xì)菌置于30 ℃ ～ 35 ℃培養(yǎng)48 h，真菌于23 ℃ ～ 28 ℃培養(yǎng)72 h 觀察計(jì)數(shù)。計(jì)數(shù)結(jié)果的2倍為淋洗取樣活菌計(jì)數(shù)結(jié)果。

拭子采樣法：

取無(wú)菌拭子，用無(wú)菌的0． 9%氯化鈉溶液5 ml 浸濕，在取樣點(diǎn)處選擇約為25 cm2取樣面上擦拭，完成后迅速將拭子放入無(wú)菌試管中并密封，加入10 ml 0． 9% 生理鹽水，使用旋渦振蕩器充分振蕩后作為供試液，取5 ml 進(jìn)行活菌計(jì)數(shù)采用薄膜過(guò)濾法過(guò)濾，濾干后取出濾膜，細(xì)菌濾面朝上貼于TSA90mm平板培養(yǎng)基和NA 90mm平板培養(yǎng)基上，真菌濾面朝上貼于SDA90mm 平板培養(yǎng)基上，細(xì)菌置于30 ℃ ～ 35 ℃ 培養(yǎng)48 h，真菌于23 ℃ ～ 28 ℃培養(yǎng)72 h 觀察計(jì)數(shù)。計(jì)數(shù)結(jié)果的2 倍為擦拭取樣活菌計(jì)數(shù)結(jié)果。

通過(guò)統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，回收率以3 次實(shí)驗(yàn)測(cè)試值的平均值計(jì)，標(biāo)準(zhǔn)要求: 回收率≥70%。

結(jié)果

低含菌量和高含菌量的載體上TSA 接觸皿、NA接觸皿、SDA 接觸皿采樣，與淋洗采樣和拭子采樣比較，回收率差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義( P ＞ 0． 05) 。接觸皿采樣、淋洗采樣、拭子采樣在低含菌量( 1 cfu /25 cm2 ～ 10 cfu /25 cm2 ) 的物體表面的采樣回收率高于在高含菌量( 50 cfu /25 cm2 ～100 cfu /25 cm2 ) 的物體表面的采樣回收率，但均能達(dá)到70%以上。

結(jié)論

在食品藥品企業(yè)生產(chǎn)車間，生產(chǎn)工具、儀器設(shè)備表面的微生物含量直接影響產(chǎn)品的最終質(zhì)量，拭子采樣法是一種較早用于表面微生物檢測(cè)的方法，但是由于拭子檢測(cè)法需要將拭子上的微生物轉(zhuǎn)移至培養(yǎng)基中，不僅增加了檢測(cè)步驟，而且容易在轉(zhuǎn)移過(guò)程中產(chǎn)生假陽(yáng)性。接觸皿采樣法作為一種表面微生物檢測(cè)方法，不僅便于使用節(jié)省人力且對(duì)使用條件要求較低，例如不需要高壓滅菌鍋、超凈臺(tái)等，因此接觸皿用于表面微生物的檢測(cè)更加方便快捷。