細菌涂片及細菌染色是微生物學的基本技術(shù)，也是觀察細菌最簡單且行之有效的方法，是微生物檢測人員常用技能之一。通常情況下，由于細菌個體較小，較透明或半透明，如未經(jīng)染色往往不以觀察識別。因此借助于染色法可以使細菌著色，與視野背景形成鮮明對比，從而易于在顯微鏡下進行觀察。

微生物檢測常見的細菌染色方法包括簡單染色、負染色、革蘭氏染色、芽孢染色法、鞭毛染色、莢膜染色、死活染色。制備細菌染色片一般要經(jīng)過涂片、固定、染色、水洗、干燥等步驟，然后用顯微鏡甚至油鏡觀察。

1. 簡單染色：

在實驗室微生物檢測過程中，不同細菌或者由于觀察者所側(cè)重觀察的內(nèi)容不同，所以使用的染料也有差異，但是簡單細菌染色的方法是一樣的。

先按照上述的制片方法制片，制成需要觀察的玻片后，使用相對應的染料滴加到玻片上的菌膜區(qū)域，以覆蓋菌膜為準。按照不同染料的要求，結(jié)合所觀察的內(nèi)容確定染色時間，染色時間到達時，進行水洗，干燥等步驟。最后得到的玻片加蓋蓋玻片即可進行鏡檢。如有需要可以后續(xù)再進行油封、蠟封等封片過程。簡單細菌染色過程如下圖：

2. 負染色

制備觀察圖片是非常容易的，但是對微生物檢測初學者來說想要在玻片中找到目標菌還是有一定難度的，因為細菌常常無色透明且比較小，所以對初學者來說除非對光圈等進行很精細的調(diào)節(jié)，否則很難觀察到目標菌，因此進行負染色就十分重要。該方法是將微生物與苯胺黑或者india墨水混合，再將混合物覆蓋于載玻片表面，由于這兩種天然黑色染料不能滲入微生物細胞，所以使得透明的微生物個體在黑色的背景下很容易觀察。負染色法常見有兩種操作方法。

第一種發(fā)個方法比較常見，在一個載玻片上將微生物與異地苯胺黑混合，用另外的載玻片將混合物均勻的覆蓋于原來的載玻片上。該方法的目的是使混合物在在玻片上一邊厚一邊薄，在厚與薄中間的額區(qū)域就是最佳觀察區(qū)域。如圖所示：

第二種方法是用一接種環(huán)苯胺黑與微生物混合，用接種針在載玻片的中央將混合物延伸很小的區(qū)域。具體操作如圖所示：

3. 革蘭氏染色

革蘭氏染色是微生物檢測細菌學中廣泛使用的一種鑒別染色法。細菌先經(jīng)堿性染料結(jié)晶紫染色，而后經(jīng)碘液進行媒染，之后用酒精脫色，在一定條件下有的細菌媒染后的顏色不會脫去，有的可以被脫去，前者叫做革蘭氏陽性菌，后者為革蘭氏陰性菌。為方便進一步觀察，脫色后再用堿性蕃紅進行復染，陽性菌仍為紫色，陰性菌染成紅色，這就是革蘭氏染色的原理。其步驟包括初染、媒染、脫色、復染四個步驟，主要步驟如圖所示：

4. 芽孢染色法

部分細菌能產(chǎn)生內(nèi)孢子，這些孢子能抵制細菌染色液的進入，在微生物檢測革蘭氏染色法涂片染色時，革蘭氏陽性菌的芽孢呈現(xiàn)無色。雖然芽孢在革蘭氏染色片中可以看到，但在不易清晰觀察時，可用特殊的芽孢染色法，使芽孢與菌體呈現(xiàn)不同顏色，便于觀察。主要的芽孢染色法有孔雀綠染色法和石碳酸復紅染色法。

孔雀綠染色法的具體步驟：首先將生有芽孢的斜面菌苔按革蘭氏染色法涂片后，用飽和孔雀綠水溶液染色10min，然后用自來水沖洗，沖洗完后用0.5%蕃紅液復染30s，用水洗，吸干，即可鏡檢，鏡檢時芽孢呈綠色，菌體和芽孢囊呈微紅色。

石碳酸蕃紅染色法具體步驟：首先按常規(guī)涂片，然后滴加石碳酸復紅于涂片上，并于玻片下緩緩加熱，使染液冒蒸汽但不沸騰，并繼續(xù)滴加染液，不使涂片上染液蒸干，這樣保持5min。帶涂片冷卻后，傾去染液，用酸性乙醇脫色指無紅色染劑洗脫為止，接著徹底水洗，洗后用呂氏美藍復染2-3min，水洗吸干后即可進行鏡檢，鏡檢時菌體計孢囊呈藍色，芽孢呈紅色。

5. 鞭毛染色法

鞭毛是細菌的運動器官，非常纖細，超出了光學顯微鏡觀察極限，因此通常情況下在顯微鏡下觀察不到。通過特殊的染色技術(shù)，可以將染色液附加到鞭毛的周圍，增加它的直徑，從而能在光學顯微鏡下觀察到鞭毛。鞭毛染色一般分銀鹽法和復紅沉淀法兩種。

這里介紹一下銀鹽沉淀法。用作鞭毛染色的載玻片必須是絕對干凈無油脂的，將載玻片在火焰上快速灼燒5s，放在染色架上冷卻，用蠟筆分成兩個區(qū)域，然后用移液管或者巴斯德移液管吸取2mL無菌水加入到幼齡生長活躍的斜面菌株中，慢慢震蕩并旋轉(zhuǎn)試管使菌株懸浮，盡量避免使用接種環(huán)，將懸液轉(zhuǎn)移到干凈的試管中，通過懸滴試驗檢查菌體的運動型，用無菌水將懸浮液稀釋至略有渾濁為止，放入20-30℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)30min，然后移取一滿環(huán)懸浮液加在已冷卻的載玻片一端，傾斜載玻片讓液滴流到蠟筆畫的中心線，在空氣中自然干燥。然后用媒染色劑媒染5min之后，慢慢用蒸餾水充分漂洗掉所有的媒染液，用熱的Fontana銀鹽覆蓋，染色5min，每隔1min更換一次染色液（Fontana銀液在沸水浴中加熱），細菌涂層的每一部分都要浸在染色液中，不能裸露。最有用水沖洗，自然晾干即可進行鏡檢。應當注意一點，染色法的燃料須當日配制，4h內(nèi)使用，最好是現(xiàn)配現(xiàn)用。

6. 莢膜染色

一般細菌的莢膜與染色劑的親和性低，但莢膜通透性高，因此染料可以透過莢膜使菌體著色。一般采用負染色方法使背景和菌體之間形成一透明區(qū)，將菌體襯托出來便于觀察分辨。

莢膜染色的步驟：加一滴6%葡萄糖水溶液在載玻片的一端，無菌操作，挑取細菌斜面上培養(yǎng)72h左右的膠質(zhì)芽孢桿菌與其混合，加1滴墨汁充分混勻，用推片法制片將菌液鋪成薄層，自然干燥，滴加1-2滴無水乙醇覆蓋涂片，固定1min，自然干燥，在已晾干的涂面上，滴加1%結(jié)晶紫染色液染色，2min后用20%的硫酸銅沖洗數(shù)次，再用自來水沖洗一次，使用擦鏡紙擦干后即可鏡檢。有莢膜的菌菌體呈紫色，背景灰黑色，莢膜不著色呈無色透明圈。具體操作過程見下圖：

7. 死活染色

細菌死活染色排除法是生物研究中判斷細胞活性的一種常用方法，是利用死活細胞在生理機能和性質(zhì)上的差異來進行的，常用的染色劑有臺盼藍和美藍，前者使用范圍較廣，后者一般在酵母菌細胞死活鑒定上使用較多。

以上介紹的細菌染色法，基本上涵蓋傳統(tǒng)微生物實驗室能用到的所有的細菌染色法。染色法在細菌的觀察、分類、鑒定中經(jīng)常用到，因此是微生物檢測人員不可或缺的基本技能之一。

轉(zhuǎn)載自《食品微生物檢測工作指南》作者賈俊濤等，轉(zhuǎn)載僅為分享知識。