SN/T 0176-2013 出口食品中蠟樣芽胞桿菌檢測  操作步驟

第一法   蠟樣芽胞桿菌平板計數(shù)法

1 蠟樣芽胞桿菌檢測

1.1 樣品的稀釋

1.1.1 固體和半固體樣品：稱取25 g樣品置于盛有225 mL磷酸鹽緩沖液或0.85 %生理鹽水的無菌均質(zhì)杯中，以8000 r/min~10000 r/min的轉(zhuǎn)速勻質(zhì)1 min~2 min，或放入盛有225 mL稀釋液的無菌均質(zhì)袋中，用排擊式均質(zhì)器拍打1 min~2 min，制成1:10樣品勻液。

1.1.2 液體樣品：以無菌吸管吸取25 mL樣品置于盛有225 mL磷酸緩沖液或0.85%生理鹽水的無菌稀釋瓶（瓶內(nèi)預(yù)置適當(dāng)數(shù)量的無菌玻璃珠）中充分混勻，制成1:10樣品勻液。

1.1.3 用1 mL的無菌吸管或微量移液器吸取1:10樣品勻液1 mL，加到盛有9 mL磷酸緩沖液或0.85 %生理鹽水的試管中，充分混勻，制成1:100的樣品勻液。

1.1.4 按1.1.3操作程序，制備10倍系列稀釋樣品勻液，直至適宜稀釋倍數(shù)。

1.2 樣品的接種

根據(jù)對樣品污染狀況的估計，選擇2~3個適宜稀釋度的樣品勻液（液體樣品可包括原液），在進(jìn)行10倍遞增稀釋時，每個稀釋度分別吸取0.1mL樣品勻液加入MYP平板瓊脂平板，然后用無菌L棒均勻涂布于整個平板，注意不要觸及平板邊緣，每個稀釋度接種兩個MYP瓊脂平板。

1.3 培養(yǎng)

1.3.1 在通常情況下，涂布之后將平皿靜置10 min~30 min，待樣品勻液吸收后翻轉(zhuǎn)平板，30℃±1℃培養(yǎng)24 h。如果培養(yǎng)物的菌落特征不顯著，則繼續(xù)培養(yǎng)至48 h。

1.3.2  蠟樣芽胞桿菌在MYP瓊脂平板上生長的典型菌落為直徑2 mm~5 mm，菌落表面粗糙，在深紅色背景下呈現(xiàn)粉紅色或微粉紅色，環(huán)繞產(chǎn)生5 mm寬的卵磷脂酶沉淀環(huán)。沒有根狀生長的特性（蕈狀芽孢桿菌形成根狀生長的特征）。

1.4 菌落計數(shù)

選取菌落數(shù)在15 CFU~150 CFU的典型或可疑蠟樣芽胞桿菌菌落的平板，進(jìn)行計數(shù)。

注：如果有很多發(fā)酵甘露醇的細(xì)菌，會影響到典型菌落，使之減少或消失。少量的蠟樣芽胞桿菌無卵磷脂酶沉淀環(huán)，這些菌同樣需要證實(shí)實(shí)驗(yàn)。

1.5 營養(yǎng)瓊脂斜面或平板培養(yǎng)基

從每個平板上挑取5個典型菌落，如無典型菌落，則挑取可疑菌落。用接種針接觸菌落中心部位，分別接種于營養(yǎng)瓊脂斜面或平板，30℃±1 ℃培養(yǎng)24 h，取培養(yǎng)物進(jìn)行革蘭氏染色和證實(shí)實(shí)驗(yàn)。

1.6 證實(shí)實(shí)驗(yàn)

1.6.1 葡萄糖發(fā)酵實(shí)驗(yàn)：將培養(yǎng)物接種到酚紅葡萄糖肉湯中，置于厭氧培養(yǎng)箱中36 ℃±1 ℃培養(yǎng)24 h，振搖后肉湯由紅變黃，表明在厭氧條件下蠟樣芽胞桿菌分解葡萄糖產(chǎn)酸。

1.6.2 硝酸鹽還原實(shí)驗(yàn)：將培養(yǎng)物接種到硝酸鹽肉湯中，36 ℃±1 ℃培養(yǎng)24 h，加0.25 mL亞硝酸鹽試劑A和0.25 mL亞硝酸鹽試劑B，在10 min內(nèi)變?yōu)榧t色為陽性反應(yīng)。

1.6.3 改良V-P實(shí)驗(yàn)：將培養(yǎng)物接種到改良V-P培養(yǎng)基中，36 ℃±1 ℃培養(yǎng)24 h，取1 mL培養(yǎng)物置于滅菌空管中加入0,2 mL40 %KOH溶液和0.6 mL5%α-萘酚乙醇溶液和少量結(jié)晶肌酸。靜置1 h出現(xiàn)伊紅粉紅色為陽性。

1.6.4 L-酪氨酸分解實(shí)驗(yàn)：將培養(yǎng)物接種到L-酪氨酸瓊脂培養(yǎng)基上，36 ℃±1 ℃培養(yǎng)48 h在靠近菌落生長的地方培養(yǎng)基為透明的，則表明酪氨酸被分解，陰性則繼續(xù)培養(yǎng)至72 h，結(jié)果仍為陰性的棄去。

1.6.5 溶菌酶試驗(yàn)：將培養(yǎng)物接種到0.001%溶菌酶營養(yǎng)肉湯中，另取培養(yǎng)物接種到普通營養(yǎng)肉湯中作為對照，36 ℃±1 ℃培養(yǎng)24 h，蠟樣芽胞桿菌在本培養(yǎng)基中能生長，為陽性反應(yīng)。如出現(xiàn)陰性反應(yīng)繼續(xù)培養(yǎng) 24 h，結(jié)果仍為陰性棄去。

1.6.6 符合MYP瓊脂上的典型菌落形態(tài)，鏡檢為革蘭氏染色陽性大桿菌，呈鏈狀，芽胞呈橢圓形位于菌體中央或偏端，并且在厭氧條件下發(fā)酵葡萄糖產(chǎn)酸，還原硝酸鹽為亞硝酸鹽，改良V-P試驗(yàn)陽性，分解L-酪氨酸，能在0.001%溶菌酶中生長的進(jìn)行如下實(shí)驗(yàn)：

1.6.7 蠟樣芽胞桿菌與類似菌的鑒別試驗(yàn)：

動力實(shí)驗(yàn)：用接種針挑取培養(yǎng)物穿刺接種于動力培養(yǎng)基中，30 ℃±1 ℃培養(yǎng)24 h。有動力的蠟樣芽胞桿菌應(yīng)沿穿刺線呈擴(kuò)散生產(chǎn)，而蕈狀芽孢桿菌常呈“絨毛狀”生長。

溶血試驗(yàn)：將疑似菌點(diǎn)種在綿羊血瓊脂表面，30 ℃±1 ℃培養(yǎng)24 h。蠟樣芽胞桿菌會觀察到強(qiáng)烈的β-溶血反應(yīng)。蘇云金芽胞桿菌和蕈狀芽胞桿菌呈現(xiàn)弱溶血現(xiàn)象，而炭疽芽孢桿菌通常為不溶血。

蛋白毒素結(jié)晶試驗(yàn)：取經(jīng)30 ℃±1 ℃培養(yǎng)24 h并于室溫放置2 d~3 d的營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)物少許于載玻片上，用滅菌蒸餾水做顯微涂片。待干燥后將涂片慢慢通過火焰，短暫加熱固定。待冷卻后，用甲醇蓋滿涂片，30 s后棄去甲醇，通過火焰使其充分干燥，再將涂片蓋滿0.5 %堿性復(fù)紅水溶液或石碳酸復(fù)紅ZN染色液。用微火輕輕從底部加熱玻片至產(chǎn)生蒸汽為止。過1 min~2 min，再重復(fù)這個步驟。靜置30 s，棄去染液。用蒸餾水充分沖洗玻片，待其自然干燥。在顯微鏡油鏡下觀察是否有游離的芽孢和毒素晶體。如果未見游離芽孢，可將培養(yǎng)物在室溫下多放置幾天后進(jìn)行試驗(yàn)。蘇云金芽胞桿菌產(chǎn)生四角晶形（菱形）的暗色蛋白毒素晶體，蠟樣芽胞桿菌不產(chǎn)生毒素晶體。

1.6.8 符合蠟樣芽胞菌群特征的，呈強(qiáng)烈溶血，有活潑的動力，不產(chǎn)生蛋白毒素結(jié)晶的培養(yǎng)物，可確定為蠟樣芽胞桿菌。

1.7 可替代的生化實(shí)驗(yàn)

如選擇API 50 CHB生化鑒定試劑盒或VITEK全自動微生物鑒定系統(tǒng)，可按照1.5從營養(yǎng)瓊脂斜面或平板上挑取培養(yǎng)物，用生理鹽水制備成濁度適當(dāng)（根據(jù)儀器要求）的菌懸液，使用API 50 CHB生化鑒定試劑盒或VITEK全自動微生物鑒定系統(tǒng)進(jìn)行鑒定。

2 結(jié)果計算

2.1 平板上的有效菌落數(shù)的計算見式（1）

a=b/A*C················（1）

式中：

a——平板上的有效菌落數(shù)；

b——根據(jù)證實(shí)實(shí)驗(yàn)確定為蠟樣芽胞桿菌的菌落數(shù)；

A——進(jìn)行證實(shí)實(shí)驗(yàn)的菌落數(shù)；

C——平板上的菌落數(shù)。

同一稀釋度有效菌落數(shù)的平均值計算公式見（2）

···············（2）

式中:

——同一稀釋度有效菌落數(shù)的平均值；

——同一稀釋度有效菌落數(shù)的和。

若有兩個連續(xù)稀釋度的平板菌落數(shù)在適宜計數(shù)范圍內(nèi)時，按（3）計算：

················（3）

N——樣品中蠟樣芽胞桿菌數(shù)；

——連續(xù)兩個稀釋度的有效菌落數(shù)的平均數(shù)之和；

V——加樣量（0.1 mL或1 mL）;

d——連續(xù)兩個稀釋度中較低的稀釋度。

例：將檢樣1^0-5、10^-6連續(xù)兩個梯度稀釋液0.1 mL涂布于MYP瓊脂平板上，生成的疑似蠟樣芽胞桿菌菌落數(shù)分別為137、148和21、17個，各取5個進(jìn)行鑒定，證實(shí)為蠟樣芽胞桿菌的分別為3、4和4、4個，則每一稀釋度的有效菌落數(shù)的平均數(shù)分別為100、15 CFU。則1 g樣品中蠟樣芽胞桿菌數(shù)為：

(100+15)/(0.1*11*10^-3)=115/(1.1*10^-6)) =1.0×10⁸ CFU/g

2.2 若同一稀釋度屁股辦上只有一個平板菌落在適宜范圍之內(nèi)，則計算此平板的有效菌落數(shù)，然后與其相鄰稀釋度的有效菌落數(shù)的平均值求和，再通過式（3）計算求值，即為每克（或毫升）中蠟樣芽胞桿菌。

2.3 若只有一個稀釋度平板上的菌落數(shù)在適宜范圍內(nèi)，計算此稀釋度的有效菌落數(shù)的平均值，再將平均值乘以相應(yīng)稀釋倍數(shù)再除以加樣量，即為每克（或毫升）中蠟樣芽胞桿菌數(shù)。

2.4 若所有稀釋度的平板上菌落數(shù)均大于150 CFU，則對稀釋度最高的平板進(jìn)行計數(shù)，計算此稀釋度有效菌落數(shù)的平均值，再將平均值乘以相應(yīng)稀釋倍數(shù)再除以加樣量，即為每克（或毫升）樣品中蠟樣芽胞桿菌數(shù)。

2.5 若所有稀釋度的平板菌落數(shù)均小于15 CFU，則對稀釋度最低的平板進(jìn)行計數(shù)，計算此稀釋度有效菌落數(shù)的平均值，再將平均值乘以相應(yīng)稀釋倍數(shù)再除以加樣量，即為每克（或毫升）樣品中蠟樣芽胞桿菌數(shù)。

2.6 若所有稀釋度的平板菌落數(shù)均不在15 CFU~150 CFU之間，其中一部分小于15 CFU而另一部分大于150 CFU時，則最接近15 CFU或150 CFU的平板進(jìn)行計數(shù)，計算此稀釋度有效菌落數(shù)的平均值，再將平均值乘以相應(yīng)稀釋倍數(shù)再除以加樣量，即為每克（或毫升）樣品中蠟樣芽胞桿菌數(shù)。

3 蠟樣芽胞桿菌平板計數(shù)的報告

根據(jù)MYP瓊脂平板上蠟樣芽胞桿菌的典型菌落數(shù)，按2中公式計算，報告每克（或毫升）樣品中蠟樣芽胞桿菌數(shù)，以CFU/g（或CFU/mL）表示；如果最低稀釋倍數(shù)的兩個培養(yǎng)皿均沒有菌生長則結(jié)果可表述為每克（或毫升）樣品中蠟樣芽胞桿菌數(shù)小于1乘以最低稀釋倍數(shù)（如果是液態(tài)樣品的原液，則結(jié)果可以表述為每毫升樣品中蠟樣芽胞桿菌數(shù)小于1）。

第二法   蠟樣芽胞桿菌MPN計數(shù)

3檢驗(yàn)程序

3.1 蠟樣芽胞桿菌MPN計數(shù)法檢驗(yàn)程序見圖2

3.2 MPN計數(shù)法試用于蠟樣芽胞桿菌數(shù)≤10³/g的情況

4 操作步驟

4.1樣品的稀釋

樣品的稀釋按1.1進(jìn)行.

4.2樣品的接種和培養(yǎng)

每個樣品選擇三個適宜的連續(xù)稀釋度的樣品勻液（液體樣品可選擇原液），每個稀釋度接種3管已酪胨大豆多粘菌素肉湯（TSPB），每管接種1 Ml.（如果接種量超過1 mL，則用雙料 TSPB，每管接種10 mL），30 ℃培養(yǎng)48 h。

4.3 分離

從出現(xiàn)渾濁的試管取培養(yǎng)物劃線接種到MYP瓊脂上，30 ℃±1 ℃培養(yǎng)24 h。如果培養(yǎng)物特征不顯著，可延長培養(yǎng)24 h。蠟樣芽胞桿菌在MYP 瓊脂平板上典型的菌落為表面粗糙，在深紅色背景下呈現(xiàn)粉紅色或微粉紅色，環(huán)繞產(chǎn)生5 mm寬的卵磷脂酶沉淀環(huán)，沒有根狀生長的特性。

4.4 營養(yǎng)瓊脂斜面或平板培養(yǎng)

從每個MYP瓊脂平板上挑取5個典型菌落，如無典型菌落則挑取可疑菌落。用接種針接觸 菌落中心部位，分別接種于營養(yǎng)瓊脂斜面或平板，30 ℃±1 ℃培養(yǎng)24 h，取培養(yǎng)物進(jìn)行革蘭氏染色和證實(shí)實(shí)驗(yàn)。

4.5證實(shí)實(shí)驗(yàn)

證實(shí)實(shí)驗(yàn)按1.6、1.7進(jìn)行。

5 蠟樣芽胞桿菌MPN計數(shù)結(jié)果報告

根據(jù)證實(shí)實(shí)驗(yàn)確定為蠟樣芽胞桿菌的管數(shù)，只要有1個菌落鑒定為蠟樣芽胞桿菌，其所代表的TSPB管即為蠟樣芽胞桿菌陽性。依據(jù)TSPB陽性管數(shù)查MPN表（見行標(biāo)附錄B），報告每克（或毫升）樣品中蠟樣芽胞桿菌MPN值。

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