一、微生物菌種保藏的意義 

       菌種是從事微生物學(xué)及生命科學(xué)研究的基本材料，在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中，診斷制品的制備，菌苗的生產(chǎn)、微生物致病性研究，藥物的抑菌試驗(yàn)及藥品微生物檢驗(yàn)等都有一套完整的菌種.微生物具有生命活力，在傳代過程中易發(fā)生變異甚至死亡，因此菌種保藏是一項(xiàng)重要的基礎(chǔ)工作，是微生物學(xué)基礎(chǔ)工作的一項(xiàng)重要內(nèi)容，也是藥品微生物工作中的一項(xiàng)常用技術(shù)。 

       如藥品中的控制菌檢查使用的陽性對照菌須防止因多次傳代而使陽性對照菌的典型生物學(xué)特征發(fā)生變化及菌株的死亡，保證達(dá)到菌種長期正確的形態(tài)； 

       如藥品微生物學(xué)檢驗(yàn)過程中，檢出的可疑致病菌須妥善保藏，以達(dá)到進(jìn)一步鑒定的目的，保證用藥安全。

二、微生物菌種代號的意義

國內(nèi)藥品微生物檢驗(yàn)所用的菌種代號是

CMCC（F）或 CMCC（B）

CMCC —— 中國醫(yī)學(xué)菌種保藏中心

B —— 代表細(xì)菌，

F ——代表真菌。

大腸桿菌 [CMCC (B) 44102]

乙型副傷寒沙門桿菌 [CMCC (B) 50094]

銅綠假單胞菌 [CMCC (B)10104]

金黃色葡萄球菌 [CMCC (B)26003]

生孢梭菌[CMCC(B)64941]

白色念珠菌[CMCC(F)98001]

三、常用微生物菌種保藏方法

  (一) 微生物菌種保藏的原理 

       根據(jù)微生物的菌種生理、生化特性，在人工創(chuàng)造的條件下盡量降低微生物細(xì)胞的代謝強(qiáng)度，使細(xì)胞基本處于休眠狀態(tài)，生長繁殖受到抑制但又不至于死亡，以減低菌種的變異率。低溫、干燥、缺氧、缺乏營養(yǎng)等環(huán)境條件都有抑制微生物的代謝作用。因此，低溫、干燥、真空是用于菌種保藏的重要手段。

       選擇保藏方法時，首先應(yīng)考慮方法能否長期地保持菌種原有的特性，同時也應(yīng)兼顧到方法的經(jīng)濟(jì)和簡便。在實(shí)際工作中，往往多種條件同時使用,以提高保藏效果。 

 （二）微生物菌種保藏步驟 

① 挑選特征典型的純菌菌落；

② 確定保藏的合適菌體形態(tài)；

③ 選擇最適宜的保藏方法；

④ 定期對保藏菌種進(jìn)行檢查，觀察是否發(fā)生變化，若有變化，須改變保藏方法。保藏期滿應(yīng)及時進(jìn)行移種。

1. 瓊脂斜面低溫保存法

（1）方法：將經(jīng)常使用的菌種的典型菌落接種在斜面（某些特殊菌種可用液體培養(yǎng)基）上，按規(guī)定的溫度和時間培養(yǎng)，待充分生長后，把培養(yǎng)好的新鮮菌種用牛皮紙保好，為減緩培養(yǎng)基的水分蒸發(fā)，延長保藏時間，可將菌種保藏管的棉花塞換成橡膠塞。放在4℃左右的冰箱中保藏。每隔 2~3個月移種一次，繼續(xù)進(jìn)行保藏。若用半固體高層培養(yǎng)基穿刺培養(yǎng)，一般可保藏半年 ~ 一年。有的甚至更長時間。

（2）適用范圍：細(xì)菌、酵母菌、霉菌保藏。

  (3）特點(diǎn)：

 優(yōu)點(diǎn)是——簡便，易于推廣；一般不需要另選擇保藏用培養(yǎng)基；對大多數(shù)微生物都適用。

 缺點(diǎn)是——保藏期太短；傳代次數(shù)多，易發(fā)生變異及污染。

（4）注意事項(xiàng)：

• 保藏的菌種應(yīng)是生命活力旺盛的新鮮培養(yǎng)物，至少應(yīng)是第三代的培養(yǎng)物。
•  保藏時，破傷風(fēng)桿菌可用庖肉培養(yǎng)基；生孢梭菌用流體硫乙醇酸鹽培養(yǎng)基。
• 必須定期檢查保藏菌種冰箱的溫度、濕度以及菌種管的棉塞是否松動或生霉，如有異常應(yīng)及時處理。
• 每次移植后，應(yīng)與原菌種的編號、名稱逐一核對，確證培養(yǎng)基特征和純度無誤后再繼續(xù)保藏。
• 保藏菌種的培養(yǎng)基應(yīng)無糖，其他菌類含糖小于 2 %為宜，以免產(chǎn)酸過多，影響菌種存活。
• 銅綠假單胞菌在冰箱中易發(fā)生菌體自溶而死亡，不宜用本法保存。

2、液體石蠟保存法：

   本法是用石蠟將培養(yǎng)物與空氣隔絕，以降低菌種的生理生化水平，并可防止水分蒸發(fā)，從而延長菌種的保藏期。

（1）方法：

• 將菌種接種于斜面或穿刺于0.3~ 0.5 %瓊脂半固體高層培養(yǎng)基中，培養(yǎng)好備用。取化學(xué)純的液體石蠟裝在試管中，每管10~15ml，加棉塞，瓶口包上紙，121℃高壓滅菌30min，取出置37℃溫箱或 110~ 170 ℃烤箱中 1 ~ 2 h 或干燥器內(nèi)除去液體石蠟中的水分。
• 將上述液體石蠟加入培養(yǎng)好的菌種試管內(nèi)，液體石蠟液面以高出培養(yǎng)基最上端 1㎝為宜，將試管直立，放入4℃冰箱中保藏。
•  適用范圍：適用于保藏部分霉菌，酵母菌和放線菌，對細(xì)菌保藏效果較差。

（2）液體石蠟對各類菌種保藏效果

（3）特點(diǎn) 本方法簡便易行，是實(shí)驗(yàn)室常用的一種保藏方法，該法主要使菌種與空氣隔絕。

（4）注意事項(xiàng)：

① 保藏時，用新鮮培養(yǎng)物接種，應(yīng)檢查純度和特征后，方可進(jìn)行保藏。

② 保藏過程中，需經(jīng)常觀察斜面是否干燥，如干燥， 需重新移種。

③ 使用菌種時，先將菌種管傾斜使液體石蠟流至一邊，再用接種針挑取培養(yǎng)物接種到新

鮮斜面上培 養(yǎng)，待長出新培養(yǎng)物后，再移種一次到新斜面上 即可使用。

④ 將沾有少量液體石蠟的接種針浸于95%酒精中片刻，再燒灼滅菌，以免直接在酒精燈下

燒灼時，液體石蠟四濺，引起污染。

⑤ 液體石蠟在菌種管中高出培養(yǎng)基的高度要嚴(yán)格控制，如太多，會影響菌種交換氣體，使

保藏效果不好；如太少，斜面容易干燥，將縮短保藏期。一般以高出斜面1 ㎝為宜。

⑥ 制備無菌液體石蠟時，每管裝量不能太多，否則分裝到菌種培養(yǎng)基中易造成污染。

四、試驗(yàn)用微生物菌種的培養(yǎng)傳代方法

程序：

• 檢定用標(biāo)準(zhǔn)菌種，由中國藥品生物檢定所提供，為冷凍干燥菌種。
• 菌種的復(fù)蘇與保存在專用無菌室或超凈工作臺內(nèi)進(jìn)行。
• 菌種傳代次數(shù)不應(yīng)超過5次。

1、 菌種的復(fù)蘇

• 把凍干菌種管、滅菌1ml 滴管、雙碟、鑷子、營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基、營養(yǎng)瓊脂斜面數(shù)支，移入接種室或凈化工作臺。
• 先用砂輪將凍干菌種安瓶頸部挫出刻痕,再將凍干菌種管外壁用碘酒擦洗消毒、稍干，用75% 乙醇棉擦凈，放在滅菌雙碟內(nèi)，待干。點(diǎn)燃酒精燈，將菌種管的封口一端在火焰上，燒灼紅熱，用滅菌滴管吸取營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基，滴在灼熱的菌種管封口一端，使驟冷而炸裂。
• 取滅菌鑷子，在火焰旁，將炸裂的管口打開，放入滅菌雙碟內(nèi)，另取1支滅菌滴管，在火焰旁吸取營養(yǎng)肉湯少許，加至菌種管底部，將凍干菌攪動促使溶解，隨即吸出管內(nèi)菌液，分別接種至營養(yǎng)瓊脂斜面及普通肉湯內(nèi)，并將滴管及菌種管投入消毒液內(nèi)，將已接種的營養(yǎng)肉湯及營養(yǎng)瓊脂斜面置35~37℃培養(yǎng)22~24 h。
• 取出培養(yǎng)物，仔細(xì)觀察菌苔形態(tài)、有無雜菌、涂片、革蘭氏染色鏡檢，呈典型菌落后，轉(zhuǎn)種3 代即可應(yīng)用。如發(fā)現(xiàn)菌型不典型，可進(jìn)行平板分離單菌落。

2、菌種的傳代與保存

方法

（1）： 菌斜面菌斜面（保存）

• 培養(yǎng)基應(yīng)新鮮制備，如斜面已無冷凝水者，不宜再使用。標(biāo)簽上著名菌名及接種日期。至冰箱取出的菌種斜面，應(yīng)在室溫放置約30分鐘，待溫度平衡后再移入接種室或超凈工作臺。
• 點(diǎn)燃酒精燈，用左手握住菌種斜面，將管口靠進(jìn)火焰旁，右手拿接種棒后端，將接種環(huán)燒紅30秒，隨后將全部接種棒金屬部分在火焰上燒灼，往返通過3次。左手將管口在火焰上旋轉(zhuǎn)燒灼，右手用無名指、小指及掌部夾住棉塞，撥開棉塞，將接種環(huán)伸人管內(nèi)先在近壁的瓊脂斜面上靠一下，稍冷卻再移至菌苔上，刮去少量菌苔，隨即取出接種棒，并將菌種管口移至火焰旁。
• 堵上棉塞，左手將菌種管放下，取營養(yǎng)瓊脂斜面1支，照上述操作打開棉塞，將接種環(huán)伸入管內(nèi)至瓊脂斜面的低部，由底向上，將接種環(huán)輕貼斜面的表面曲折移動，使細(xì)菌劃在斜面的表面上。
• 取出接種棒，在火焰旁將培養(yǎng)基管棉塞堵上，然后將接種過細(xì)菌的接種棒在火焰上燒灼滅菌。
• 將已接種畢的細(xì)菌管置35~37℃培養(yǎng)22~24小時，霉菌管一般置20~25℃霉菌培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)7日。取出后放人冰箱保存，一般 3個月轉(zhuǎn)種一次。

方法

（2）：菌斜面營養(yǎng)肉湯分離平板菌斜面

如果菌落形態(tài)不典型可純化，按下列方法傳代（分離菌落） ：

用接種環(huán)取上述菌管（斜面）菌苔少許接種置營養(yǎng)肉湯中(5ml/支,已滅菌), 置35~37℃培養(yǎng)18~24小時后，再用接種環(huán)取培養(yǎng)好的營養(yǎng)肉湯菌懸液（濃菌液），接種于分離平板，置35~37℃培養(yǎng)18~24小時，用接種針選典型菌落劃線于營養(yǎng)瓊脂斜面，置35~37℃培養(yǎng)18~24小時。一般同時接種幾支管，其中一支用于以后菌種傳代或接種到半固體瓊脂培養(yǎng)基中，其它用做工作菌種。

常用分離平板：

大腸埃希菌——EMB瓊脂平板

銅綠假單胞菌——溴化十六烷三甲銨瓊脂培養(yǎng)基

金黃色葡萄球菌——甘露醇氯化鈉瓊脂培養(yǎng)基

3 菌懸液的制備

取上述培養(yǎng)好的菌種斜面移入接種室或凈化工作臺，放置室溫后, 用接種環(huán)取菌苔少許接種置營養(yǎng)肉湯中(5ml/支,已滅菌), 將已接種畢的細(xì)菌管置35~37℃培養(yǎng)18~24小時，取出備用。一般于冰箱中保存可用7天。

4 對照用菌液制備

取上述培養(yǎng)好的營養(yǎng)肉湯菌懸液（濃菌液）1ml，加到9ml 0.9%無菌氯化鈉溶液混勻，為10-1，再取另一只吸管吸取10-1菌液1 ml加到9ml 0.9%無菌氯化鈉溶液混勻，為10-2 ……以此類推，稀釋至含活菌數(shù)在 50 ~ 100 個。用平板計(jì)數(shù)。此稀釋菌液用于試驗(yàn)后加陽性對照，可在1天內(nèi)使用。

五、微生物菌種保管

• 菌種保管應(yīng)有專人負(fù)責(zé)，保存與加鎖的冰箱中或特制的白鐵箱中加鎖置陰暗處，確保菌種安全。因工作變動時，必須做好交接工作。
• 菌種應(yīng)有詳細(xì)登記本，包括名稱、分離日期、鑒定日期、鑒定者、主要鑒定性能，并注意記錄使用、轉(zhuǎn)移及銷毀情況和原因。
• 各種菌種應(yīng)按規(guī)定時間定期移種。一般每移種3次后作一次全面鑒定。注意菌種有無污染和變異，如發(fā)現(xiàn)污染和變異時，應(yīng)及時更換。
•  購置菌種，應(yīng)有介紹信。全部保存菌種應(yīng)具備清單，并定期向部門負(fù)責(zé)人報(bào)告。